三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲这4 种含氮量较高且性质稳定、价格低廉的化合物被称作伪蛋白。添加到乳制品中使得蛋白质的含量远高于其实际含量，从而提高乳制品的附加值。同时，这类伪蛋白可作为动植物饲料，被广泛的应用于反刍动物饲养以及草场肥料等方面，也大大增加了其进入乳制品中的风险，严重危害人类健康，阻碍企业乃至行业的生存发展。目前食品安全国家标准规定的蛋白质测定方法为凯氏定氮法，该法通过测定氮元素的含量间接对食品中蛋白质进行定量，而不是测定蛋白质的真实值。
东北农业大学黑龙江省绿色食品科学研究院，东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室的单 艺、王象欣和东宁出入境检验检疫局的马 微*等人利用磁性分子印迹技术，以缩二脲-13C2和环丙氨嗪-D4为模板分子，Fe3O4为磁性纳米颗粒，制备对三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲具有特异性识别的磁性分子印迹聚合物（MMIPs）。MMIPs结合同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法，实现乳及乳制品中伪蛋白的特异性分离、富集和定性及定量分析。该方法快速、灵敏、准确度高，为磁性分子印迹技术在乳制品检测中的应用提供理论依据。
1、MMIPs的合成与分子识别
本实验利用共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米微球，与传统方法相比，采用微波进行熟化处理使得Fe3O4结晶程度提高；加入油酸和PEG-6000对其进行包裹，PEG-6000的疏水端和油酸的疏水端形成双层胶束，使磁性粒子能很好地分散在溶液中。添加PVP使Fe3O4纳米颗粒在水中洗涤几次或强力搅拌后仍能长时间稳定分散，并且放置4 个月以上没有沉淀产生。在外磁场作用下伪蛋白磁性印迹聚合物迅速吸附沉降，具有很好的磁敏感性。由于三聚氰胺与环丙氨嗪有相似的化学结构，缩二脲与双氰胺也有类似化学结构，本实验选择环丙氨嗪和缩二脲的2 种同位素，即环丙氨嗪-D4和缩二脲- 13C2作为模拟印迹分子合成MMIPs，可以对4 种化合物进行特异性吸附，避免了4 种化合物之间的测定干扰。
2、MMIPs吸附性能的测定
随着平衡浓度的增加，4 种伪蛋白被MMIPs吸附的含量显著增加，MMIPs对双氰胺、缩二脲、三聚氰胺、环丙氨嗪均具有较好的特异性吸附能力。MMIPs和MNIP对4 种伪蛋白的吸附量具有显著差异。这是由于MMIPs中形成了带有与印记分子互补且空间上固定排列的分子印迹位点，当印记分子进入“孔穴”中时，与其中的官能团发生对应的结合作用，能够更好地吸附目标分子。而对于MNIP来说，由于不具有特异性的印迹位点，其与底物产生结合作用属于物理吸附，无规律性，所以MNIP的吸附量变化不显著。
3、色谱条件与质谱条件的选择
双氰胺、缩二脲、三聚氰胺、环丙氨嗪均属于分子结构带有氨基的有机胺类强极性化合物，所以使用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱，亲水相互作用色谱模式（HILIC模式）对其进行分离。电喷雾电离模式为正离子模式，故在流动相中加入甲酸加强目标化合物的质子化效果。但是实验中发现0.1%甲酸和乙腈作为流动相，进行梯度洗脱时化合物峰形和线性关系均不理想，分析原因或为流动相pH值过低，因此在流动相中引入缓冲盐，使其保持相对稳定的酸度。通过实验发现，用含1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵溶液和乙腈对待测物进行梯度洗脱时，线性关系良好、峰形明显改善。
4、提取条件的优化
提取方式
双氰胺、缩二脲、三聚氰胺、环丙氨嗪均微溶于水，可溶于乙腈、甲醇等有机溶剂中，直接加入2 种MMIPs进行吸附，乳制品中大量的蛋白均会覆盖2 种MMIPs的表面，会影响2 种MMIPs对目标化合物的吸附。故选择乙腈-水（50∶50，V/V）预先除去大部分蛋白，再加入2 种MMIPs进行特异性吸附。
MMIPs的用量
结果显示，当2 种MMIPs添加量在20～150 mg时，4 种化合物的回收率均随着MMIPs添加量的增加而增加；当2 种MMIPs添加量大于150 mg时，4 种化合物的回收率不再增加。此4 种化合物的最小回收率为95.2%。由此得出添加150 mg 2 种MMIPs完全满足样品测定的需要。
提取时间的选择
对不同吸附时间（1～15 min）的4 种化合物的回收率进行测定。当吸附时间在1～6 min时，此4 种化合物的平均回收率从35.1%增加到95.1%，当吸附时间大于6 min时，此4 种化合物的平均回收率没有显著增加，所以确定最佳吸附时间为6 min。
清洗溶剂的选择
结果表明，使用3 mL 10%甲醇溶液对MMIPs表面进行清洗，4 种化合物回收率均比较高。
洗脱溶剂的选择
经过比较实验，本方法加入1 mL甲醇-乙酸（95∶5，V/V）溶液对4 种化合物进行洗脱，反复6 次。为了提高提取效率，洗脱时使用超声波进行辅助提取。实验结果表明，使用该洗脱方式，4 种目标化合物均可被完全洗脱。
5、样品基质效应
在乳制品中，由于配方复杂且蛋白质等物质的存在，离子抑制十分明显。经研究采用MMIPs进行净化排除干扰物质，并结合清洗和洗脱，同时添加同位素内标抵消质谱离子化时的基质效应，从而消除了基质效应。
6、线性范围及检出限测定结果
在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，以待测物质量浓度（X）为横坐标，以标准品与内标物峰面积比（Y）为纵坐标绘制标准溶液工作曲线。经检测发现，三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲4 种伪蛋白各自的质量浓度与相应的峰面积比值（伪蛋白峰的面积/三聚氰胺-三胺-15N3峰面积）呈良好的线性关系，相关系数均达到0.999 0以上。
7、回收率和精密度测定结果
结果显示，双氰胺的平均加标回收率为82.8%～95.5%，相对标准偏差为2.5%～9.2%；缩二脲的平均加标回收率为80.5%～94.2%，相对标准偏差为1.1%～7.2%；三聚氰胺的平均加标回收率为88.6%～95.6%，相对标准偏差为3.1%～6.9%；环丙氨嗪的平均加标回收率为83.5%～96.1%，相对标准偏差为2.1%～7.5%。
8、实际样品测定结果
对市售的30 种乳制品进行分析测定，利用本方法对每个样品重复测定3 次，结果表明三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲含量均小于方法检出限。
结 论
本实验以缩二脲-13C2和环丙氨嗪-D4为印记分子，MAA为功能单体，EGDMA为交联剂，Fe3O4为磁性组分成功制备出对三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲有特异选择吸附性能MMIPs。此外，该聚合物具有很好的磁性，在完成对目标物的吸附后，可以在外加磁场作用下实现动态快速分离，使提取过程更加方便、快捷。应用超高效液相色谱-串联质谱联用技术，对提取出来的三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲进行色谱分离、定性、定量分析，其结果准确、可靠。
